賽默飛世爾（Thermo Fisher Scientific）是生命科學(xué)領(lǐng)域的品牌，提供了多種類型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀器，其中7300和7500系列是其中應(yīng)用廣泛的兩款機(jī)型。兩者均適用于基因表達(dá)分析、基因分型、相對(duì)定量檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。本文將詳細(xì)介紹賽默飛7300和7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器的主要功能、應(yīng)用領(lǐng)域，以及如何在相對(duì)定量測(cè)定中使用這些儀器。

一、賽默飛7300和7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：賽默飛7300和7500 qPCR 儀器概述

1.1 7300 qPCR儀器

7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是一個(gè)多功能的qPCR平臺(tái)，專為中低通量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，適用于研究級(jí)別的應(yīng)用。該儀器支持96孔板，具有高精度和高重復(fù)性，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)定量、SNP基因分型以及微生物檢測(cè)等領(lǐng)域。

主要特點(diǎn)：

• 兼容SYBR Green、TaqMan等多種化學(xué)探針。

• 精確的溫控系統(tǒng)，確保PCR擴(kuò)增過(guò)程中的穩(wěn)定性。

• 靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)，能夠捕捉弱信號(hào)。

• 用戶友好的軟件界面，提供直觀的數(shù)據(jù)分析工具。

7300 PCR系統(tǒng)設(shè)計(jì)緊湊，操作簡(jiǎn)便，非常適合小型實(shí)驗(yàn)室或初學(xué)者使用。

1.2 7500 qPCR儀器

7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器則是7300的升級(jí)版本，具備更高的靈敏度和更廣泛的應(yīng)用能力。7500系列包括7500標(biāo)準(zhǔn)型和7500 Fast型兩個(gè)版本，前者是常規(guī)應(yīng)用的理想選擇，而后者則在縮短實(shí)驗(yàn)周期和提高通量方面表現(xiàn)出色。

主要特點(diǎn)：

• 支持SYBR Green、TaqMan探針以及其他熒光探針系統(tǒng)。

• 快速模式能夠在更短時(shí)間內(nèi)完成qPCR循環(huán)。

• 適合多重定量PCR，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)。

• 提供更廣泛的溫度梯度，支持更復(fù)雜的PCR實(shí)驗(yàn)。

• 精準(zhǔn)的光學(xué)系統(tǒng)和多通道熒光檢測(cè)。

7500系統(tǒng)適用于需要快速結(jié)果的高通量實(shí)驗(yàn)，特別是在臨床診斷、藥物研發(fā)以及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用中表現(xiàn)優(yōu)異。

二、賽默飛7300和7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：相對(duì)定量PCR原理及其在7300和7500上的應(yīng)用

2.1 相對(duì)定量PCR原理

相對(duì)定量PCR是指通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因在PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的熒光信號(hào)，來(lái)計(jì)算目標(biāo)基因的表達(dá)水平相對(duì)于內(nèi)參基因的變化。該方法的核心思想是在檢測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)樣本之間比較目的基因的表達(dá)量變化，從而得出實(shí)驗(yàn)樣本中的基因相對(duì)表達(dá)量。

通常情況下，相對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)涉及以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：

1. RNA提取與反轉(zhuǎn)錄： 從細(xì)胞或組織中提取總RNA，隨后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。

2. qPCR反應(yīng)： 在7300或7500系統(tǒng)中，使用SYBR Green或TaqMan探針設(shè)計(jì)的引物對(duì)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒庑盘?hào)的積累。

3. 數(shù)據(jù)分析： 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化方法，將目標(biāo)基因的表達(dá)量相對(duì)于內(nèi)參基因進(jìn)行計(jì)算，通常采用△△Ct方法（也稱作2^-△△Ct方法）來(lái)得到相對(duì)表達(dá)量。

2.2 在7300和7500系統(tǒng)上的應(yīng)用

7300和7500 qPCR儀器均可以出色地執(zhí)行相對(duì)定量分析。在相對(duì)定量分析中，數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性是關(guān)鍵，因此儀器的溫控精度、熒光探測(cè)靈敏度和軟件的數(shù)據(jù)處理能力都直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

7300系統(tǒng)中的相對(duì)定量測(cè)定：

• 7300系統(tǒng)雖然相對(duì)基礎(chǔ)，但其穩(wěn)定的光學(xué)和溫控性能仍然能夠支持相對(duì)定量PCR的準(zhǔn)確測(cè)量。對(duì)于研究級(jí)的實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的定量研究，7300能夠提供可靠的數(shù)據(jù)。

• 利用SYBR Green或TaqMan化學(xué)探針，用戶可以監(jiān)測(cè)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的Ct值，隨后使用配套的軟件計(jì)算相對(duì)定量數(shù)據(jù)。

7500系統(tǒng)中的相對(duì)定量測(cè)定：

• 7500系統(tǒng)在性能上優(yōu)于7300，尤其是7500 Fast型，通過(guò)更快的熱循環(huán)和高效的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，大幅縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)保證了數(shù)據(jù)的精度。對(duì)于需要處理大量樣本的實(shí)驗(yàn)，7500可以更高效地完成相對(duì)定量分析。

• 7500系統(tǒng)還提供了更多的熒光通道，支持多重?zé)晒鈽?biāo)記，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。這種功能在復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中尤其有用，如同時(shí)分析多個(gè)靶基因和內(nèi)參基因的表達(dá)量。

三、7300和7500系統(tǒng)中相對(duì)定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 樣本準(zhǔn)備

在進(jìn)行相對(duì)定量PCR之前，確保樣本的RNA質(zhì)量高且一致。劣質(zhì)的RNA樣品會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄效率和后續(xù)的qPCR擴(kuò)增效率，進(jìn)而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的定量結(jié)果。因此，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前的RNA純化步驟至關(guān)重要。

• 內(nèi)參基因選擇： 選擇一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因（如GAPDH、ACTB等）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。理想的內(nèi)參基因在實(shí)驗(yàn)條件下應(yīng)保持穩(wěn)定表達(dá)，否則會(huì)引入誤差。

3.2 qPCR反應(yīng)設(shè)置

• 引物設(shè)計(jì)： 無(wú)論使用SYBR Green還是TaqMan探針，均需確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。確保目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的引物具有相似的擴(kuò)增效率是相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

• 反應(yīng)體系： 實(shí)驗(yàn)中需要優(yōu)化反應(yīng)體系的條件，如Mg2?濃度、退火溫度等，以確保最佳的擴(kuò)增效率和反應(yīng)特異性。賽默飛的7300和7500系統(tǒng)支持溫度梯度優(yōu)化，可以幫助快速找到最佳條件。

3.3 數(shù)據(jù)獲取與分析

在qPCR實(shí)驗(yàn)完成后，系統(tǒng)將生成Ct值（Cycle threshold），表示熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)數(shù)。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵是通過(guò)計(jì)算△Ct值（目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的Ct差值），并使用2^-△△Ct公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

數(shù)據(jù)分析步驟：

1. 計(jì)算每個(gè)樣本的目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的△Ct值。

2. 比較實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本之間的△Ct值，計(jì)算△△Ct。

3. 使用2^-△△Ct公式計(jì)算目標(biāo)基因在實(shí)驗(yàn)樣本中的相對(duì)表達(dá)水平。

賽默飛7300和7500系統(tǒng)配備了用戶友好的數(shù)據(jù)分析軟件，可以自動(dòng)計(jì)算△Ct和△△Ct值，生成直觀的相對(duì)定量數(shù)據(jù)，方便研究人員快速得出結(jié)論。

四、7300和7500 qPCR系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

7300和7500系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用中有諸多優(yōu)勢(shì)，特別是在相對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)。

• 高靈敏度檢測(cè)： 兩款儀器均配備高靈敏度光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，能夠檢測(cè)到極低濃度的目標(biāo)基因表達(dá)，適合低豐度基因的定量分析。

• 高精度溫控： 精確的溫度控制對(duì)于PCR反應(yīng)的成功至關(guān)重要。7300和7500系統(tǒng)具備高精度的溫控模塊，確保每一個(gè)PCR循環(huán)的穩(wěn)定性。

• 數(shù)據(jù)處理便捷： 配套的軟件系統(tǒng)支持豐富的分析功能，用戶可以輕松完成數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、定量分析及結(jié)果可視化。

五、結(jié)論

賽默飛7300和7500 qPCR系統(tǒng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出色，特別是在相對(duì)定量分析中，其靈敏度、精確的溫控系統(tǒng)以及強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析軟件，使其成為生命科學(xué)研究中的重要工具。7300系統(tǒng)適合中小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室的研究應(yīng)用，而7500系統(tǒng)則以其更快的反應(yīng)速度和多通道檢測(cè)能力適用于大規(guī)模高通量分析。無(wú)論是基礎(chǔ)研究還是臨床診斷，這兩款儀器都能夠滿足用戶的多樣化需求。